Navigation und Service

Sie befinden sich im Bereich:Projekte

Projekte

Projekte Spezielle Indikationen

Rolle der Dipeptidyl-Peptidase 4 (DPP4)

Pia Zilleßen, Peter Mayer

Projektziel:
Gliptine (DPP4-Inhibitoren) stellen eine neue Wirkstoffklasse der Antidiabetika dar [1]. Das Enzym DPP4 ist an vielen biologischen Prozessen beteiligt, indirekt auch an der Glukosehomöostase [2][4]. Kürzlich wurde DPP4 zudem als Adipokin beschrieben [3]. Bestimmte Adipokine und Entzündungsmediatoren sind mit der Manifestation eines Diabetes assoziiert. Eine direkte Beteiligung der DPP4 steht noch zur Diskussion. In der Studie sollen daher die Funktionen von DPP4 in humanen Adipozyten, später auch in anderen Zelltypen, untersucht werden.

Methodik:
Es werden Protein-und Genexpressionsanalysen (Western Blot, qPCR) an In-vitro-Systemen sowie DNA-Array-Analysen verwendet, zudem die lentivirale Transduktion von siRNA und Zellproliferations-und Migrationsmessungen.

Ergebnisse:
Mittels der lentiviralen Transduktion wurde ein spezifischer Knock-down des DPP4-Gens für weitere Analysen erzeugt. Der DPP4-Knock-down veränderte die Expression von zahlreichen weiteren Genen in den Adipozyten. Detaillierte Untersuchungen folgen.
Schlussfolgerung. Das Verständnis der Rolle von DPP4 sowie verwandter Enzyme ist von großer Bedeutung für den gezielten und selektiven Einsatz von Antidiabetika. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse sind von enormem Nutzen zur Aufdeckung von sog. Off-target-Effekten der Gliptine.

Referenzen:
1. Dobrian AD, Ma Q, Lindsay JW et al (2010) Dipeptidyl peptidase IV inhibitor sitagliptin reduces local inflammation in adipose tissue and in pancreatic islets of obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 300(2):E410–E421
2. Drucker DJ (2007) Dipeptidyl peptidase-4 inhibition and the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Care 30(6):1335–1343
3. Lamers D, Famulla S, Wronkowitz N et al (2011) Dipeptidyl peptidase 4 is a novel adipokine potentially linking obesity to the metabolic syndrome. Diabetes 60(7):1917–1925
4. Yu DM, Wang XM, McCaughan GW, Gorell MD (2006) Extraenzymatic functions of the dipeptidyl peptidase IV-related proteins DP8 and DP9 in cell adhesion, migration and apoptosis. FEBS J 273(11):2447–2460

Effekte von Sulfonylharnstoffen auf (Prä-)Adipozyten

Moritz Hass, Bernd-Bodo Haas

Projektziel:
Der Transkriptionsfaktor Peroxisom-Proliferator-aktivierter-Rezeptor γ (PPARγ ) spielt eine maßgebliche Rolle in der Fettzelldifferenzierung. Projektziel ist es zu untersuchen, ob Sulfonylharnstoffe (SH) und strukturverwandte Substanzen das Phosphorylierungsmuster von PPARγ verändern, wie es von Glitazonen bekannt ist [1][3], und welchen Einfluss sie auf die Insulinsensitivitat von Adipozyten haben. Eigene Vorarbeiten haben gezeigt, dass SH einen Einfluss auf PPARγ und die Expression von Zytokinen haben [2]. In diesem Zuge soll der Mechanismus der Zytokinexpression und deren Beeinflussbarkeit durch Testsubstanzen aufgeklärt werden.

Methoden:
Die Studien werden an humanen primären Adipozyten durchgeführt. Mittels phosphospezifischer Western Blots und eigens entwickelten ELISAs wird der Phosphorylierungsstatus von PPARγ untersucht. Durch Knockdown-Studien und Überexpression mittels lentiviralem Gentransfer und Mutagenese der Phosphorylierungsstellen wird mit CHIP-Analysen und Realtime-PCR die Zytokinexpression untersucht und der Effekt der Wirkstoffe auf diese charakterisiert. Mit Kolokalisationstudien und In-vitro-Tests werden direkte Interaktionen von PPARγ und den Wirkstoffen nachgewiesen. Erste Ergebnisse deuten auf eine Beeinflussung der Phosphorylierung von PPARγ durch SH hin. Die Phosphorylierungsänderung geht mit einem positiven antidiabetischen Expressionsprofil einher.

Schlussfolgerung:
Glitazone werden wegen ihrer Nebenwirkungen zunehmend kritisch betrachtet. Der antidiabetische Effekt und die erwünschte Reduktion der Insulinresistenz scheinen mit dem Phos-phorylierungsstatus von PPARγ korreliert zu sein [1][3]. Mit der Aufklärung des Mechanismus soll der Grundstein für antidiabetische Wirkstoffe mit einem günstigeren Nutzen-Risiko-Verhältnis gelegt werden.

Referenzen:
1. Choi JH, Banks AS, Estall JL et al (2010) Antidiabetic drugs inhibit obesity-linked phosphorylation of PPARgamma by Cdk5. Nature 466(7305):451–456
2. Mayer P, Haas B, Celner J et al (2011) Glitazone-like action of glimepirideand glibenclamide in primary human adipocytes. Diabetes Obes Metab 13(9):791–799
3. Choi JH, Banks AS, Kamenecka TM (2011) Antidiabetic actions of a non-agonist PPARγ ligand blocking Cdk5-mediated phosphorylation. Nature 477(7365):477–481

Interaktionen von proteinhaltigen Parenteralia mit elastomeren
Bestandteilen der Primärverpackung

Carolin Richter, Cornelia Lipperheide, Uwe Lipke, Thomas Zapf, Alf Lamprecht*

Projektziel:
Es soll untersucht werden, ob flüssige Parenteralia während der Lagerung mit „Leachables“ kontaminiert werden, die durch Kontakt mit dem Arzneimittel aus dem Gummistopfen in die Formulierung diffundieren. Neben der qualitativen und quantitativen Bestimmung der „Leachables“ soll auch deren Einfluss auf die Stabilität proteinhaltiger Arzneimittel erforscht werden.

Methodik:
Um ein maximales Leachables-Profil von Gummistopfen zu erzielen, wurden käuflich erworbene Stopfen mit Isopropanol unter Reflux extrahiert. Ferner wurde die Migration der Leachables in wässrige Arzneimittelformulierungen unter ICH-Lagerungsbedingungen überprüft. Zur Untersuchung des Einflusses der Leachables auf die Stabilität von Proteinen wurde der mit Isopropanol extrahierte Extrakt eines Gummistopfens mit IgG als Modellprotein versetzt.
Ergebnisse. Es zeigten sich deutliche qualitative und quantitative Unterschiede bei den Leachables-Profilen der untersuchten Gummistopfen, obwohl sie alle Arzneibuchqualität entsprachen. Die Anwesenheit des Lösungsvermittlers Polysorbat in der wässrigen Arzneimittelformulierung verstärkte die Migration auch von unpolaren Substanzen aus dem Gummistopfen. Mögliche Strukturveränderungen bei IgG wurden mit verschiedenen analytischen Methoden untersucht.
Schlussfolgerung. Das erarbeitete Untersuchungsverfahren eignet sich für die Auswahl eines kompatiblen Gummistopfens für proteinhaltige Arzneimittellösungen.
*Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

Neue Methoden zur Charakterisierung pflanzlicher Arzneimittel

Annika Orland, Werner Knöss

Projektziel:
Die Identität und Qualität von Arzneipflanzen ist eine Grundvoraussetzung, um deren therapeutische Wirksamkeit und Unbedenklichkeit zu gewährleisten. Das Projekt verfolgt die Fragestellung, inwieweit moderne Methoden basierend auf „Omics“-Techniken sinnvoll eingesetzt werden können.

Methodik:
NMR-Fingerprint, HPLC, PCR, qPCR, Microarray, zellbiologische Methoden.

Ergebnisse:
Bisherige Untersuchungen zeigen, dass eine Vielzahl europäischer Arzneipflanzen mit PCR-basierten Techniken identifiziert werden kann. Unterschiedliche Extrakte können mit NMR-Fingerprints und einer anschließenden Hauptkomponentenanalyse differenziert werden, und Muster in Genexpressionsprofilen konnten beobachtet werden.

Schlussfolgerung:
„Omics“-basierte Technologien können ergänzend mit PCR-basierten Methoden [1] und metabolic fingerprints [2] zur Identifizierung und Authentifizierung herangezogen werden. Zur Einschätzung des toxischen Potenzials von Arzneipflanzen können Genexpressionsprofile zusätzlichen Nutzen bringen, die Anwendbarkeit der bisherigen Beispiele sollte weiter überprüft werden.

Referenzen:
1. Kersten T, Daniel C, König GM, Knöß W (2008) Das Potential PCR-basierter Markermethoden zur Identifizierung von Arzneipflanzen. Z Phytother 29(3):122–128
2. Daniel C, Kersten T, Kehraus S et al (2008) Identifizierung und Charakterisierung von Arzneipflanzen mit „Metabolic Fingerprinting“. Z Phytother 29(6):270–274

Bestrahlung von Granulozyten

Ines Preuth, Josef Zündorf, Dirk von Mallek, Stephan Garbe*

Projektziel:
Die primären Effektorzellen des Immunsystems zur Abwehr bakterieller Infektionen sind die neutrophilen Granulozyten (PMN). Aus therapeutischer Sicht hat niedrig dosierte Radiotherapie eine empirisch gut belegte, antiinflammatorische Wirksamkeit [1]. Bei der Strahlentherapie, beispielsweise von Gesichtsfurunkeln, wurden Einzeldosen von 0,2 und 0,5 Gy angegeben, die den Krankheitsprozess zur Rückbildung brachten [2]. Der zugrunde liegende Mechanismus ist bisher nicht bekannt und soll näher erörtert werden.

Methodik:
Heparinisiertes, humanes Vollblut wird homogen bestrahlt. Der Einfluss der ionisierenden Strahlung auf die Aktivierung, die Phagozytose und das Killing pathogener Mikroorganismen durch PMN wird bestimmt.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen:
Die Aktivierung (CD11b-und CD66b-Expression) von PMN geht nach Bestrahlung mit F-18 Fluorid leicht zurück. Derselbe Effekt zeigt sich bei der Phagozytose von S. aureus durch PMN. Die gezeigten Änderungen der Antikörperexpression nach Bestrahlung hat wahrscheinlich auch Einfluss auf andere PMN Funktionen. Diese werden im weiteren Projektverlauf untersucht. Aus regulatorischer Sicht lassen sich möglicherweise aus den Ergebnissen des Projektes Maßstäbe ableiten, die für die Ri-sikobewertung von Vorkommnissen mit radioaktiven Medizinprodukten bedeutsam sind.

Referenzen:
1. Freund F (1927) Zum Wirkungsmechanismus der Röntgenstrahlen bei entzündlichen Erkrankungen. Klin Wochenschr 6(31):1462–1465
2. Hess F (1987) Die Strahlentherapie gutartiger Erkrankungen. In: Scherer E (Hrsg) Strahlentherapie Radiologische Onkologie, 3. Auflage. Springer, Berlin, S 354–369
* Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

Funktion und Regulation des granulozytären Alleinstellungsmerkmals
CD66b und dessen Bedeutung für die Phagozytose pathogener
Mikroorganismen

Alva Brodesser, Thomas Schmidt*, Norbert Schnitzler**, Thomas Grüger, Josef Zündorf

Projektziel:
Die Funktion des Oberflächenrezeptors CD66b auf Granulozyten ist bisher nicht bekannt [1]. Bisher wurde vermutet, dass die CD66b Expression als Koexpression mit CD11b/CD18 erfolgt, über welches Komplementopsonisierte Bakterien phagozytiert werden. In dem Projekt wird untersucht, ob die CD66b-Expression auf Granulozyten unabhängig von anderen Rezeptoren erfolgt, welche Bedeutung CD66b für die Phagozytose hat und ob diese durch Modulation von CD66b beeinflussbar ist.

Methodik:
Die Stimulierung der Granulozyten erfolgt in humanem Vollblut durch Überstand von Staphylococcus aureus. Anschließende Experimente sind die Bestimmung der Rezeptorexpression durch Einsatz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern und die Bestimmung der Phagozytose von S. aureus durch PMN. Die Analyse erfolgt über Durchflusszytometrie (FACSCalibur, ImageStreamX).

Ergebnisse:
Bakterienüberstand induziert eine überschießende CD66b Expression. Die Expression anderer Rezeptoren wie CD11b wird kaum beeinflusst. Das Ausmaß der CD66b Expression korreliert mit der Aggregation der Granulozyten und hat eine phagozytosehemmende Wirkung.

Schlussfolgerung:
CD66b spielt in der Zellaggregation eine wichtige Rolle und ist unabhängig von CD11b reguliert. Inwieweit durch Modulation von CD66b die Phagozytose beeinflusst werden kann, soll in weiteren Experimenten untersucht werden.

Referenzen:
1. Schröder AK, Uciechowski P, Fleischer D, Rink L (2006) Crosslinking of CD66b on peripheral blood neutrop-hils mediates the release of Interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol 67(9):676–682
*Philipps-Universität Marburg
**Gesundheitsamt des Kreises Düren

Identifizierung wirkmechanismusabhängiger Biomarker (gen)toxischer Kanzerogene

Florian Engel, Roland Frötschl

Projektziel:
Untersucht werden klassenspezifische Effekte von Substanzen aus verschiedenen genotoxischen Wirkklassen auf die p53-Modifikation, die Expression von p53-Pathway-assozierten Genen, den Zellzyklus und die Apoptose. Die Analyse soll potenzielle klassenspezifische Biomarker in 3 Zellkultursystemen aus Blut (TK6), Leber (HepG2) und ZNS (SH-SY5Y) zur besseren Beurteilung des mutagenen Potenzials liefern.

Methodik:
In Zytotoxizitätstests werden die Behandlungskonzentrationen für 10 Substanzen (6 genotoxische, 2 nichtgenotoxische Kanzerogene sowie 2 Neurotoxine) in den Zellkultursystemen ermittelt und im Comet-und Mikrokerntest, Expressionsprofiling, ELISA und Western Blot untersucht.

Ergebnisse. Die erwartete Genotoxizität der eingesetzten Substanzen konnte durch die bisherigen Untersuchungen gezeigt werden. Erste Expressionsprofilergebnisse der Substanzen im Vergleich zeigen spezifische Unterschiede im Expressionsmuster mit Zeit-sowie Konzentrationsabhängigkeit. Erste Western Blot-und ELISA-Untersuchungen bestätigen dies auch für die p53-Modifikation und Proteinsynthese.

Schlussfolgerung:
Dieser In-vitro-Ansatz soll für die Risikobewertung von Arzneimitteln sowie beim Screening von neuen Substanzen einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung der AM-Sicherheit sowie zur Reduktion von Tierversuchen leisten.

Gallium-68- und Fluor-18-markierte Annexin-V-Analoga zur Darstellung vulnerabler Plaques der Koronargefäße mittel PET/CT

Yasmin Hashlamun, Stefan Guhlke*, Dirk von Mallek

Projektziel:
Projektziel ist die Synthese geeigneter Annexin-V-Analoga, welche mit 68Ga und [18F]-Fluorid markiert werden können. Diese Tracer sollen zur Detektion vulnerabler Plaques herangezogen werden, da Annexin-V die darin enthaltenen apoptotischen Zellen detektieren kann [1].

Methodik:
Die Fluoridmarkierung des Annexin-V-Analogons erfolgt mittels Chelatisierung, einer sehr vielversprechenden Methode. Der Zeitfaktor aufgrund der kurzen Halbwertszeiten der Radionuklide und die physiologischen Bedingungen spielen bei den Untersuchungen eine entscheidende Rolle.
Zur Herstellung des Vorläufers aus Protein und bifunktionellem Chelator, wie z. B. NOTA-NCS, wird bei Raumtemperatur nach 24 h das beste Ergebnis erzielt. Durch anschließende Reinigung mittels PD10-Säule kann eine reine Protein-Chelator-Fraktion erhalten werden, welche dann mit Gallium-68 oder Fluor-18 markiert werden kann.
Aus Aluminium und Fluor-18 wird zunächst ein Aluminiumfluoridkomplex hergestellt, welcher als (Al-18F)x+ vorliegt [2] und von den entsprechenden Chelatoren komplexiert werden kann, wie schon durch McBride [3][4] beschrieben.

Ergebnisse und Schlussfolgerung:
Mit dieser Methode konnten gute Ausbeuten eines radioaktiv markierten Annexin-V-Analogons erhalten werden, welcher in einem möglichen nächsten Schritt mit apoptotischen Zellen in vitro umgesetzt werden könnte.

Referenzen:
1. Murakami Y, Takamatsu H, Taki J et al (2004) 18F-labelled annexin V: a PET tracer for apoptosis imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging 31(4):469–474
2. Martin RB (1996) Ternary complexes of Al3+ and F- with a third ligand. Coord Chem Rev 141:23–32
3. McBride WJ, Sharkey RM, Karacay H et al (2009) A novel method of 18F radiolabeling for PET. J Nucl Med 50(6):991–998
4. Laverman P, McBride WJ, Sharkey RM (2010) A novel facile method of labeling octreotide with (18)F-fluorine. J Nucl Med 51(3):454–461
*Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn